缺血性神經(jīng)細胞損傷有神經(jīng)元壞死和凋亡兩種方式。神經(jīng)元一旦死亡就不可再生，這是腦缺血患者致殘的根本原因。在胚胎、成年動物甚至人腦中可分離出一種未分化的原始細胞，因其具有自我更新能力和多潛能分化能力，稱之為神經(jīng)干細胞[1]，其為修復缺血性腦卒中后遺癥提供了理論基礎。2005～2006年，我們研究了神經(jīng)干細胞移植對缺血性腦卒中大鼠模型(tMCAO)后遺癥的修復作用，并確定移植的最佳時機。
1 材料與方法
1．1 實驗動物 實驗動物(Wistar大鼠)由山東大學動物實驗中．心提供。取Wistar雄性大鼠(體質(zhì)量28O～32'0 g)制備tMCA0。干細胞培養(yǎng)取自Wista孕鼠(孕14 d)胎鼠腦。
1．2 主要實驗器材 試劑超凈工作臺、COz恒溫培養(yǎng)箱、熒光顯微鏡、KOPF鼠立體定向儀、全自動微量注射器(UMP22型)和冰凍切片機等。DMEM／F12，B27，堿性成纖維生長因子(bFGF)，表皮生長因子(EGF)，抗巢蛋白(nestin)單抗，抗5一溴脫氧尿核苷(BrdU)單抗。BrdU一抗為鼠抗BrdU 抗體，二抗為羊抗鼠IgG—CY3，抗膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)多抗，抗微管蛋白一2(MAP一2)單抗。
1．3 神經(jīng)干細胞的制備取孕14 d Wistar大鼠的胚胎，分離出海馬組織，機械消化至呈單細胞懸液，按Vescoi方法制備[2]。經(jīng)機械消化后連續(xù)傳代(6次)。
1．4 tMCAO的建立與分組 按Hayashi等的方法建立tMCAO。右大腦中動脈阻斷時間為2 h。tMCAO建立后3d，對所有動物進行神經(jīng)損害程度評分(NSS)：10～14分為重度損傷，5～9分中度損傷，1～4分為輕度損傷。評分后分成移植對照組(A組，移植與神經(jīng)干細胞懸液同等量的PBS)、超早期治療組(B組，術(shù)后1 d移植神經(jīng)干細胞)、早期治療組(C組，術(shù)后3 d移植神經(jīng)干細胞)和晚期治療組(D組，術(shù)后7 d移植神經(jīng)干細胞)。每組10只。
1．5 神經(jīng)干細胞移植分別在tMCAO制備后的第2、4、8天進行神經(jīng)干細胞移植。移植前神經(jīng)干細胞經(jīng)BrdU(10 t~mol／I )標記，再將其溶解于PBS中，干細胞計數(shù)后將其濃度調(diào)整至2 x 1O 7／1OO ul，移植量為10u1。將大鼠麻醉、固定于立體定向儀，經(jīng)微量注射泵進行腦內(nèi)注射移植。移植速度為2ul／min。移植部位為右側(cè)紋狀體缺血半暗區(qū)，即參照鼠腦立體定向圖譜：前囟后0．5 mm、前囟右側(cè)3．5 mm，進針深度0．5 mm。注射完畢后留針10 rain，以防止液體反流。
1．6 神經(jīng)功能改善評價與統(tǒng)計學方法 分別于移植后0．5、1、2、4、6、7、8周對雄性大鼠進行NSS評分。應用Windows SPSS 1 1．5軟件對數(shù)據(jù)進行方差分析。P≤ 0．05為差異有統(tǒng)計學意義。
1．7 組織免疫熒光鑒定 于第8周NSS評分后麻醉，經(jīng)4 多聚甲醛灌注并固定取腦。于移植點附近做層厚10 bLm 的冰凍切片，根據(jù)試劑盒說明書進行操作。用Leica激光共聚焦掃描顯微鏡觀察免疫熒光雙標結(jié)果。應用BrdU單抗免疫組化法檢測培養(yǎng)細胞的增殖情況。GFAP染色陽性的星形細胞是由外源性神經(jīng)干細胞分化而成。
2 結(jié)果
2．1 神經(jīng)干細胞及其分化能力的鑒定 本實驗在神經(jīng)干細胞分化前后進行nestin抗原抗體實驗，以證明分離的細胞群是神經(jīng)干細胞。大鼠神經(jīng)干細胞體外培養(yǎng)顯示其良好的自我繁殖能力和多向分化能力。體外誘導分化可分化為神經(jīng)干細胞。分化的神經(jīng)干細胞呈網(wǎng)狀相互交錯。
2．2 各組tMCAO的評價動物出現(xiàn)前肢屈曲、向手術(shù)對側(cè)推動時傾倒、提尾旋轉(zhuǎn)、行動不協(xié)調(diào)、偏癱、不能站立和行走、痙攣、昏迷等表現(xiàn)則表示模型制作成功。本實驗建立的tMCAO均符合上述要求，NSS評分為(6．8±1．7)分。
2．3 治療后各組NSS評分與免疫學評價NSS評分見表1。大鼠腦切片免疫組化染色可見大量BrdU染色陽性的細胞散布在腦內(nèi)，證明是移植的外源性神經(jīng)干細胞的細胞株。該細胞群中還可見大量GFAP染色陽性的星形細胞，這是由外源性神經(jīng)干細胞分化而成。
3 討論
3．1 細胞移植治療腦卒中的機制和途徑無論是將細胞移植到腦卒中損傷同側(cè)還是對側(cè)半球，細胞都并不是僅僅存在于注射位點或注射側(cè)半球，而是分布于病灶側(cè)和健側(cè)半球。這說明細胞不止接受腦卒中直接損傷所產(chǎn)生的信號的指引，還接受健側(cè)半球神經(jīng)支配和重組。因此，其神經(jīng)修復的機制可能包括：① 移植的細胞遷移到損傷側(cè)，重建局部環(huán)路，這些環(huán)路足夠保持某些功能；② 移植細胞擴大健側(cè)半球的自發(fā)重組，行使或彌補損傷側(cè)半球喪失的某些功能。在早期階段，神經(jīng)功能改善可能主要是由于移植的細胞產(chǎn)生的營養(yǎng)因子在發(fā)揮作用；而在晚期階段，神經(jīng)功能改善可能主要是由于移植的細胞替代變性的宿主細胞發(fā)揮作用。骨髓基質(zhì)細胞可能主要是由于其分泌的神經(jīng)營養(yǎng)因子和細胞外基質(zhì)的作用；而神經(jīng)干細胞可能是以替代損傷神經(jīng)元、重建環(huán)路為主。
3．2 神經(jīng)干細胞移植時間 急性腦梗死，由于存在嚴重的動脈阻塞，缺少血液供應，會影響移植物的存活。L i等研究發(fā)現(xiàn)局灶性腦梗死后，缺血半暗區(qū)的細胞凋亡持續(xù)存在4周。這說明缺血性損傷是一個進展的過程。在這期間，將細胞移植到病灶周圍，興奮性毒性神經(jīng)遞質(zhì)、自由基、前炎癥介質(zhì)可能威脅移植的細胞。因此，移植時間的選擇必須考慮腦卒中恢復的自然過程，許多研究者延遲移植時間一直到功能缺損達到平臺期。然而，過分延長移植的等待時間，會導致瘢痕組織的形成，而這又不利于移植。Eriksson等 ]認為腦損傷當時的微環(huán)境不利于移植細胞的存活，可能是低氧等不利因素所致。同時，這種微環(huán)境隨著時間的延長而逐漸改善。也有人認為缺氧、缺血損傷期間或損傷后盡早進行干細胞移植有效，而對缺血性腦卒中后神經(jīng)干細胞移植的研究卻發(fā)現(xiàn)移植與損傷間隔7 d左右時移植細胞存活率最高，可能與此時的神經(jīng)毒性物質(zhì)減少，神經(jīng)營養(yǎng)因子釋放和血管發(fā)生有關[6]。我們認為，卒中3 d后移植較合適。本C組NSS評分最低。
影響神經(jīng)干細胞移植療效的具體機制目前尚未明確，考慮可能與多因素(除移植時間外還可能與移植位點 、移植細胞量 。 等)有關。在本實驗中，我們在不同時間采用立體定向移植到大鼠的腦缺血區(qū)域，并且移植后對大鼠的功能恢復進行評價，免疫組織化學方法染色檢查存活的細胞。顯示了神經(jīng)干細胞具有減輕缺血后神經(jīng)功能損害的作用，并且我們認為在早期移植具有最佳的效果。首先，B、C、D組NSS評分明顯低于A 組，說明神經(jīng)干細胞在宿主腦內(nèi)遷移和分化；其次，C組的NSS評分低于B、D組，說明腦損傷后早期的微環(huán)境較利于移植細胞的存活。 |
